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產品詳情
操作說明
注意事項
產品信息
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產品名稱 |
規格 |
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T7 High Yield Transcription Kit |
50T |
產品簡介
本試劑盒是利用T7 RNA Polymerase，以含有T7啟動子的線性化質粒DNA、PCR產物或合成的DNA為模板，以NTP為底物，在體外轉錄合成RNA。本試劑盒優化了RNA體外轉錄反應體系，可以簡單快速獲得大量的RNA分子，如果轉錄時在底物中加入修飾的核苷酸，可以制備生物素或染料標記的RNA。本試劑盒主要用于體外翻譯、RNase保護實驗、雜交探針標記、RNA剪切等生物實驗。在反應體系中1 μg的模板投入量可以產生大于100 μg的RNA，適用于制備長度100-5000 nt的RNA。
儲存與運輸
冰袋（wet ice）運輸；-20℃保存，12個月有效。
組成
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Component |
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T7 RNA Transcription Enzyme Mix |
200 μL |
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5×T7 Transcription Reaction Buffer |
250 μL |
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25 mM NTP Mix |
100 μL |
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DNase I |
50 μL |
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Nuclease Free Water |
1 mL |
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Control Template (0.5 μg/μL) |
10 μL |
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說明書 |
1份 |
操作步驟
1. 模板準備：
a. 以T7啟動子的質粒為模板：為了得到特定長度的RNA，質粒模板必須完全線性化（需要純化后作為模板），且線性化的質粒確保雙鏈為平末端或5’突出端（避免出現3’突出端），每個反應建議模板量為1 μg；
b. 以T7啟動子的PCR產物或合成的DNA片段為模板：PCR擴增模板時將T7啟動子（5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’）加到非編碼鏈引物的5‘端。PCR產物可以不經純化直接作為轉錄模板，但純化后會產出更多的RNA，每個反應建議模板量為0.5 μg左右。
2. 轉錄反應：按照表格推薦反應體系在潔凈的EP管中加入各種試劑，充分混勻后于37℃反應2 h。（如合成小于300 nt的RNA，建議將反應時間延長至4 h或更長時間）。
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Component |
Volume |
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Template |
0.5-1 μg |
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5×T7 Transcription Reaction Buffer |
4 μL |
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25 mM NTP Mix |
2 μL |
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T7 RNA Transcription Enzyme Mix |
4 μL |
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Nuclease Free Water |
To 20 μL |
3. 反應完畢后向體系中加入1 μL DNase I，37℃反應15 min，消化轉錄的DNA模板。
4. 轉錄合成的RNA經電泳分析、純化后，可用于下游實驗。
5. 轉錄產物定量、檢測：通過紫外吸收法可以測定RNA濃度（游離核苷酸會影響定量的準確性，RNA產物需要純化）；電泳檢測推薦采用1%甲醛瓊脂糖變性膠檢測，電泳液為1×MOPS Buffer（10×MOPS Buffer：0.4 M MOPS，pH 7.0，0.1 M Sodium Acetate，10 mM EDTA）。凝膠制備方法：稱取0.5 g瓊脂糖加入36 mL RNase-Free Water中，加熱溶化后，加入5 mL 10×MOPS Buffer。待溶液冷卻至不燙手時，加入9 mL甲醛溶液（37%），混勻后倒膠。電泳檢測時取適量RNA與RNA Loading Buffer混合，70℃孵育10 min后冰浴2 min，全部點樣。電泳結束后用EB或SerRed染色觀察。
注意事項
1. 人體皮膚表面含有豐富的RNase，實驗時請帶好實驗手套、口罩，實驗耗材無菌無酶，防止RNase污染。
2. 如需制備標記RNA，請替換試劑盒中的NTP Mix。
3. 試劑盒中對照模板轉錄長度為500 nt。
4. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
產品僅供科研用途，不用于臨床診斷！
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