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產品詳情
操作說明
注意事項
細胞描述
小鼠胚胎干細胞。該細胞缺乏 HGPRT（HPRT），并且對 0.06 mM 的 6-硫鳥嘌呤有抗性。當在飼養層（胚胎成纖維細胞或 STO 細胞）上培養時，細胞保持未分化狀態。在沒有飼養層的情況下，細胞自發分化并形成胚胎結構。當注入胚泡中時，細胞可以進入生殖系。在常規的分子基因修飾技術之后，它們可用于重構小鼠胚胎。培養時需使用昆明白MEF作為飼養層細胞。
細胞特性
1） 來源：小鼠，129/Ola品系，胚胎內細胞團
2） 形態：球形克隆 貼壁生長
3） 含量：>1x106 細胞數
4） 規格：1mL凍存管包裝
5） 用途：僅供科研使用
運輸和保存
干冰運輸：1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇，若發現干冰已揮發干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯系。
一．培養基及培養凍存條件準備：
1）準備DMEM 基礎培養基 81%
優質胎牛血清 15 %
GlutaMAX-1谷氨酰胺 1 %
MEM NEAA非必需氨基酸 1%
Sodium Pyruvate丙酮酸鈉 1%
P/S青霉素-鏈霉素 1%
β-巰基乙醇 0.5 mL（1000X)
LIF 5μg（10ng/mL）
使用昆明白MEF作為飼養層細胞。
2）培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：完全培養液 60%%，FBS 30%%，DMSO 10%%現用現配。
我庫凍存時，體積為 500 μl，預期存活率 70%，每支凍存管的細胞復蘇，3 至4 天后，會形成 30 至 40 個克隆，建議復蘇至 1 個 T25 培養瓶中。
二：細胞處理：
MEF 細胞鋪制：
1. 在 T25 培養瓶中加入 0.2%明膠，搖勻后覆蓋底面即可，于 37℃細胞培養箱至少放置 15 min 以上。
2. 吸除 0.2%明膠，加入事先水浴加熱至 37℃的 MEF 完全培養液。一般地，一個 T25 培養瓶中加入 5 ml MEF 完全培養液。
3. 按實驗需要：小鼠胚胎干細胞使用 KM-r P3 MEF 或 CF-1 P3 MEF；復蘇 MEF 細胞若干支。將凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
4. 將凍存管內細胞懸液轉移至含 2 ml MEF 完全培養液的 15 ml 離心管內，以1000 rpm，離心 5 min，離心后將上清液吸除，另加入新鮮的 MEF 完全培養液 1 ml，重懸后按照一個 T25 培養瓶鋪 1′106 的 MEF 細胞，平均加入到 T25 培養瓶中，輕輕搖勻后置于 37℃細胞培養箱。24 h 以后可以傳入小鼠胚胎干細胞。
5.復蘇或傳代小鼠胚胎干細胞前，將 T25 培養瓶中的 MEF 完全培養液吸除，加入 2 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養液輕輕沖洗一遍后吸除，加入新鮮的小鼠胚胎干細胞完全培養液待用。
復蘇：
1.將小鼠胚胎干細胞凍存管從液氮中取出，置于 37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內用 75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
2. 將凍存管內細胞懸液轉移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養液的 15ml 離心管內，以 1000 rpm，離心 5 min。
3. 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的小鼠胚胎干細胞完全培養液 2 ml，吹打懸浮。
4. 重復吹打，制成單細胞懸液，盡量避免氣泡。
5. 轉移至 1 個已經鋪好 MEF 細胞的 T25 培養瓶中培養。
6. 每天更換小鼠胚胎干細胞完全培養液。
傳代：
1. 一般在復蘇后第 2-3 天傳代，視克隆大小和密度而定
2. 吸除廢液。
3. 用 PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。
4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶（含 EDTA）至培養瓶，輕輕晃動，使胰酶覆蓋底面，置于 37℃培養箱內消化細胞。
5. 在顯微鏡下觀察，直至細胞層全部脫落（一般需要 1-2 min）。
6. 加 2 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養液終止消化。
7. 以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清。
8. 加入約 1 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養液，多次輕輕吹打細胞， 制成單細胞懸液。
9. 加入足量的小鼠胚胎干細胞完全培養液，吹打混勻，細胞懸液分裝到鋪好 MEF 細胞的 T25 培養瓶中。一般地，一個 T25 培養瓶加入 5-6 ml 培養液。放入 37℃培養箱內培養。每天換液。
傳代比例：1:4-1:7
凍存：
1.按傳代的方法將細胞消化下來，制成細胞懸液。
2. 以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清，逐滴加入已經預冷的凍存液，懸浮細胞。
3. 按每支存管內加入 500 ml 細胞懸液分裝到凍存管內，標記細胞名稱、代數、凍存日期等基本信息。
4．將凍存管置于程序降溫盒內，-80℃過夜，轉入液氮。
凍存液配方：
小鼠胚胎干細胞完全培養液 60%，ES 級 FBS 30%，DMSO 10%
附：小鼠胚胎干細胞與 MEF 細胞分離的簡易方法（差速貼壁法）：
1.培養中的小鼠胚胎干細胞，按傳代的操作方法將細胞用胰酶消化并吹打成單細胞懸液后，加入適量的提前溫育好的小鼠胚胎干細胞完全培養液重懸細胞， 吹打混勻，細胞懸液分裝到無 MEF 細胞的培養皿或培養瓶（一般地，一個T25 培養瓶中培養的小鼠胚胎干細胞，在一個 10 cm 培養皿中進行差速貼壁。不要事先鋪明膠，如鋪明膠則細胞貼壁速度過快無法有效分離小鼠胚胎干細胞與 MEF 細胞）中。
2. 培養皿或培養瓶置于 37°C 培養箱內靜置 1 小時。
3. 1 小時后，絕大部分 MEF 細胞已貼在培養皿或培養瓶底面，而大部分小鼠胚胎干細胞仍然懸浮在培養液中。收取培養液，進行后續實驗。
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