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產品詳情
操作說明
注意事項
產品簡介
細胞周期是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程，主要分為細胞分裂間期與有絲分裂期（M期）兩個階段；細胞間期主要由DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）組成，整個細胞周期變化順序可用G1→S→G2→M來表示。首先G1時期：細胞主要合成RNA和蛋白質等物質，為細胞進入S期做好物質和能量的準備；隨后進入S期：細胞開始進行DNA和一些組蛋白等物質合成，細胞DNA含量開始增加；最后到G2期：這時細胞DNA含量已經變成了G1時期的2倍，并已經停止了DNA的復制，為進入有絲分裂期做大量的蛋白質等物質的合成；如果G0（細胞暫時停止分裂和分化期、靜止期）/G1期，細胞中DNA含量為1N；那么處于G2期的細胞中DNA含量為2N；而處于G1和G2時期之間的S期細胞，DNA含量在1N~2N之間；而凋亡的細胞，細胞核會發生濃縮和DNA片段化，導致部分基因組DNA片段丟失，所以其DNA含量是小于1N的，在流式檢測的熒光圖上出現所謂的sub-G1峰，即凋亡細胞峰。因此，可根據細胞DNA的含量來判斷細胞所處的周期和狀態。
細胞凋亡也可以用流式細胞儀觀察細胞光散射的變化來檢測。細胞發生凋亡時，由于胞漿和染色質濃縮、核碎裂，產生凋亡小體，使細胞的光散射性質發生變化。凋亡前期，染色質皺縮，細胞密度增加，前向角光散射色顯著降低；凋亡后期，細胞產生凋亡小體，前向角光散射和側向角光散色均顯著降低。
細胞周期與凋亡檢測試劑盒（Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit）采用了經典的碘化丙啶染色(Propidium staining)方法對細胞周期與凋亡進行檢測分析。利用碘化丙啶能夠嵌入雙鏈DNA中，并使其產生熒光，并且熒光強度和雙鏈DNA的含量成正比的特性；結合細胞不同周期中，DNA含量的規則變化，可以區分細胞處于的周期和狀態。本試劑盒可用于組織細胞、貼壁或懸浮細胞的細胞周期與凋亡檢測（如用于組織的細胞周期與凋亡檢測，則須把組織消化成單細胞狀態，才可進行檢測）。
儲存與運輸
冰袋(wet ice)運輸；-20℃避光保存，染色緩沖液可4℃保存；12個月有效。
實驗準備
1. 含血清的細胞培養基；
2. 胰蛋白酶消化液；
3. PBS緩沖液；
4. 75%乙醇。
操作步驟
1. 細胞樣品準備（細胞數量控制在1×105~1 ×106個）
1.1. 對于貼壁細胞：去除培養液，加入胰蛋白酶消化液消化細胞，在顯微鏡下觀察到細胞變圓松動，加入適量含血清的細胞培養基終止消化，輕輕吹散細胞，將細胞制成懸液；將懸液轉移至離心管中，1000 g離心3-5 min，棄上清，保留細胞沉淀；再用預冷PBS緩沖液潤洗1-2次細胞沉淀，同樣方法離心棄上清，保留細胞沉淀。
1.2. 對于懸浮細胞：直接將細胞轉移至離心管中，1000 g離心3-5 min，棄上清，保留細胞沉淀；再用預冷PBS緩沖液潤洗1-2次細胞沉淀，同樣方法離心棄上清，保留細胞沉淀。
1.3. 對于組織細胞：將組織盡量剪切成小塊，根據組織來源，選擇胰酶、膠原酶等消化酶消化組織塊，并用100-300目篩網過濾，得到單細胞懸液；將過濾后的細胞懸液轉到離心管中，1000 g離心3-5 min，棄上清，保留細胞沉淀；再用預冷PBS緩沖液潤洗1-2次細胞沉淀，同樣方法離心棄上清，保留細胞沉淀。
2. 細胞樣品固定
2.1. 向收集的細胞沉淀樣品中加入1 mL冰上預冷的75%乙醇，輕輕吹打細胞，使其充分接觸；
2.2. 將細胞置于4℃固定30 min或更長時間（通常固定2 h或以上更能保證染色效果，固定12-24 h可能效果更佳，可提高染色效果）。
2.3. 固定一定時間后，將細胞1000 g離心3-5 min，去除乙醇固定液，保留細胞沉淀；
2.4. 輕敲離心管底部，使細胞分散，用PBS緩沖液重懸并洗滌細胞，1000 g離心3-5 min，棄上清收集細胞沉淀；
3. 染色工作液的配制與染色
3.1. 根據下表避光配制染色工作液，配制量可以根據使用需求，等比例增加或減少（配制完成的染色工作液短時間內可以4℃保存，請當日內使用）；
|
|
1個樣品 |
5個樣品 |
10個樣品 |
|
染色緩沖液 |
480 μL |
2.4 mL |
4.8 mL |
|
PI染色液（50×） |
10 μL |
50 μL |
100 μL |
|
RNaseA試劑（50×） |
10 μL |
50 μL |
100 μL |
|
總體積 |
500 μL |
2.5 mL |
5 mL |
3.2. 輕敲離心管底部，使步驟2.4中沉淀的細胞分散，再加入500 μL配制好的染色工作液，輕輕吹打，使細胞分散并與染色工作液混勻；
3.3. 37℃避光孵育30 min，即可用流式細胞儀進行檢測。
4. 流式檢測和分析
用流式細胞儀在激發波長488nm波長處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。采用適當分析軟件進行細胞DNA含量分析和光散射分析。
注意事項
1. 熒光染料均存在熒光淬滅問題，使用和保存過程中盡量避光；
2. 在實驗前建議對細胞進行周期同步化處理，避免細胞所處周期不同導致的較大重復性差異；
3. 實驗細胞種植密度不宜過高也不宜過低，以防出現接觸抑制或密度依賴等現象；4. 操作PI染色液時應注意防護，避免直接接觸人體或吸入體內；
5. 操作時請穿實驗服，佩戴一次性手套。
產品僅供科研用途，不用于臨床診斷！
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