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產品詳情
操作說明
注意事項
產品描述
乳酸脫氫酶（LDH）是糖酵解途徑的末端酶，廣泛存在于動物、植物、微生物中，參與催化丙酮酸和乳酸之間的可逆反應。通常LDH在細胞胞漿內含量豐富，正常細胞由于細胞膜的屏障保護作用，胞內LDH不能隨意通過細胞膜。但當細胞受到損傷或者死亡時，細胞膜的屏障保護作用消失，細胞內的LDH被釋放至培養液中。通過檢測細胞膜破裂釋放到培養液中的LDH含量，即可對細胞毒性進行定量分析。
乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性檢測試劑盒主要原理是利用LDH將NAD+被還原成NADH，進一步NADH和INT（四唑鹽）在Diaphorase（硫辛酰胺脫氫酶）催化下，生成NAD+和紅色甲臜，甲臜產生的量和LDH的含量成線性正相關，且能夠在490 nm波長下產生吸收峰，因此可以通過儀器進行定量分析。本試劑盒主要用于以LDH釋放為指標的細胞毒性檢測，同時也可用于以細胞總LDH為基礎的細胞增殖和毒性檢測。
儲存與運輸
冰袋(wet ice)運輸；-20℃保存，INT溶液需避光保存，酶溶液避免反復凍融；12個月有效。
操作步驟
1. 樣品前準備：
1) LDH釋放檢測樣品準備：
a. 細胞接種：將細胞以合適的密度接種于96孔細胞培養板中，可根據實驗需求設置多個分組，例如：背景空白對照孔（僅含細胞培養基）、樣品對照孔（未經處理的細胞孔）、樣品最大酶活性對照孔（未處理孔，細胞裂解后測胞內總LDH量）、處理樣品孔（實驗組）等；
b. 細胞處理：根據實驗設計，除去原有培養基，使用PBS緩沖液洗滌一次，根據分組換上對應的含藥物或者不含藥物的無血清或低血清培養基，并孵育一定時間；
c. 樣本收集：將細胞培養板1000 g離心5 min，取80 μL培養上清液，加到新的96孔板中，隨后對樣品進行測定（樣品最大酶活性對照孔的樣品準備工作，請參考細胞內總LDH檢測樣品準備步驟）。
2) 細胞內總LDH檢測樣品準備：
a. 細胞接種：將細胞以合適的密度接種于96孔細胞培養板中，可根據實驗需求設置多個分組；
b. 細胞處理：根據實驗設計，使用含藥物或者不含藥物的培養基（可含血清）孵育細胞；
c. 細胞裂解：達到預定時間后，去除原培養基，用PBS洗滌一遍，加入120 μL細胞裂解工作液（10×細胞裂解液使用PBS稀釋10倍），并于培養箱中孵育30-60 min；
d. 樣本收集：將細胞培養板1000 g離心5 min，取80 μL裂解上清液加到新的96孔板中，隨后進行測定。
3) （選做）LDH標準樣品準備：
如需對LDH酶活性的進行絕對定量，請自行購買和配制不同濃度LDH標準品，濃度可設置為10 mU/mL、5 mU/mL、2.5 mU/mL、1.25 mU/mL、0.65 mU/mL、0 mU/mL。以每孔80 μL，梯度加至96孔板中。
2. LDH檢測：
1) 根據待測樣品數量，參考下表配制適量的LDH檢測工作液（主要對應96孔板檢測，其他規格的孔板，可視情況進行調整）；
|
|
1個樣品 |
10個樣品 |
20個樣品 |
50個樣品 |
|
反應底物 |
20 μL |
200 μL |
400 μL |
1 mL |
|
INT溶液 |
2 μL |
20 μL |
40 μL |
100 μL |
|
酶溶液 |
3 μL |
30 μL |
60 μL |
150 μL |
|
反應緩沖液 |
55 μL |
550 μL |
1.1 mL |
2.75 mL |
|
總體積 |
80 μL |
800 μL |
1.6 mL |
4 mL |
2) 將LDH檢測工作液，加入到待檢測樣品孔中，每孔80 μL（樣本與LDH檢測工作液體積比為1:1），輕敲混均；
3) 將其放入細胞培養箱中，避光孵育30 min，也可用錫箔紙包裹，室溫于水平搖床上孵育30 min；
4) 使用酶標儀，在490 nm處測定吸光度?？墒褂?00 nm或大于600 nm的任一波長作為參考波長進行雙波長測定。
3. LDH結果計算：
1) 常規LDH（釋放）細胞毒性檢測：
a. 將樣品對照孔、樣品最大酶活性對照孔、處理樣品孔等OD490減去背景空白對照孔OD490，并用于后續的計算；
b. 細胞毒性或死亡率計算（%）=（處理樣品孔OD490－樣品對照孔OD490）/（樣品最大酶活性對照孔OD490－樣品對照孔OD490）×100%
2) LDH酶活性的相對定量（根據計算結果可以比較不同樣品處理組間有無統計學差異等）：
a. 測定一個已知濃度的LDH標準品OD490；
b. 待測樣品LDH活性（mU/mL）=（樣品孔OD490－背景空白對照孔OD490）/（標準品OD490－背景空白對照孔OD490）×標準品濃度（mU/mL）
3) LDH酶活性的絕對定量:
a. 測定一系列LDH梯度標準品OD490，根據所得的吸光值繪制標準曲線，并計算出趨勢公式：Y（OD490）=A×LDH活力單位（mU）+B，可通過Excel等軟件計算出趨勢線的斜率和截距；
b. 檢測體系中LDH活性（mU）=（樣品孔OD490－背景空白對照孔OD490－B）/A
樣品LDH活性（mU/mL）=檢測體系中LDH活性（mU）/檢測體積（mL）
注意事項
1. 細胞檢測時，密度不要超過85%，細胞的狀態和密度等因素都會對細胞LDH釋放造成一定的影響，且樣品準備好后，盡量當天完成檢測，不要冷凍；
2. 血清中含有乳酸脫氫酶，建議使用無血清或者低血清培養基；如必須使用10%血清，需設置無細胞對照組，以消除背景干擾；
3. 操作時盡量溫和，避免產生氣泡，以免對實驗結果產生影響；
4. 為了您的健康和安全，操作時請穿好實驗服、戴好手套。
本產品僅供科研用途，不用于臨床診斷！
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