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產品詳情
操作說明
注意事項
產品簡介
本產品BrdU檢測試劑盒，用于細胞和組織切片的細胞增殖檢測。BrdU(5-Bromo-2-deoxyUridine)，即5-溴脫氧尿嘧啶核苷，是胸腺嘧啶核苷(T)類似物，本試劑盒的原理在于，BrdU可以通過競爭替代胸腺嘧啶核苷T摻入DNA合成期(S期)。當處于旺盛分裂的細胞摻入BrdU后，利用抗BrdU抗體和抗體連接酶或熒光素作為指示系統，即可檢測出含有BrdU的細胞，結合其它細胞標記物進行雙重標記，可判斷出增殖細胞的種類、增殖速度等，對研究細胞動力學有重要意義。BrdU經活體注射或細胞培養時進入組織細胞，摻入DNA定位準確，可有效反應S期細胞新合成DNA的水平，而且受細胞內外環境影響小，標記不會丟失。
儲存與運輸
冰袋（wet ice）運輸；破膜液、封閉液（3% BSA）、1 M HCl可4℃保存，4%多聚甲醛可常溫保存，anti-BrdU (mouse mAb)需-20℃保存，有效期12個月。
實驗準備
1. 自備PBS緩沖液、二抗、梯度乙醇、封片劑等；
2. 自備細胞核染色液；
3. 配制anti-BrdU一抗工作液：將anti-BrdU(mouse mAb)用封閉液（3% BSA）稀釋100倍，配制成anti-BrdU一抗工作液，現配現用，4℃保存；
4. 二抗工作液：根據檢測需要自備HRP標記（后續經白光檢測，配套DAB顯色試劑盒，抗小鼠二抗，并用PBS稀釋配制成二抗工作液。
操作步驟
細胞樣品：
1. 細胞準備：提前準備細胞爬片，確保細胞狀態正常，貼壁良好；
2. BrdU孵育：細胞經含BrdU的培養基于培養箱中避光孵育一定時間，BrdU濃度及細胞孵育時間依據細胞種類不同，建議預實驗摸索最佳條件。注意事項中已測試細胞實驗條件可供參考；
3. 細胞固定：上述經BrdU孵育的細胞爬片，PBS洗3次，每次5 min。向孔板內加入1 mL 4%多聚甲醛覆蓋細胞，室溫固定20-30 min。PBS洗3次，每次5 min；
4. 通透：向孔板內滴加破膜液覆蓋細胞處理8-10 min，PBS洗3次，每次5 min；
5. 細胞核染色（可選）：
若后續白光檢測，則用蘇木素染細胞核：向孔板內滴加蘇木素染液室溫染色5 min，吸棄蘇木素染液，PBS洗3次，每次5 min；
若后續熒光檢測，則用DAPI染細胞核：向孔板內滴加DAPI染液室溫染色5 min，吸棄DAPI染液，PBS洗3次，每次5 min；
6. 再固定：向孔板內滴加4%多聚甲醛室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；
7. 酸化：向孔板內滴加1 M HCl覆蓋細胞，37℃處理10 min，PBS洗3次，每次5 min；
8. 后固定：再次向孔板內滴加4%多聚甲醛室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；
9. 封閉：向孔板內滴加封閉液（3% BSA）室溫孵育30 min。吸棄封閉液，不要清洗；
10. Anti-BrdU抗體孵育：向孔板內滴加anti-BrdU一抗工作液覆蓋細胞，4℃孵育過夜。吸棄anti-BrdU一抗工作液，PBS洗3次，每次5 min；
11. 二抗孵育：向孔板內滴加二抗工作液覆蓋細胞，室溫孵育1 h。吸棄二抗工作液，PBS洗3次，每次5 min。注意，若是用熒光標記的二抗，孵育及洗滌時均需避光；
12. 封片及鏡檢：
若是HRP標記的二抗，則用DAB顯色試劑對細胞樣品進行顯色，脫水，透明，用尖頭鑷子輕輕將爬片挑起，倒扣在潔凈的載玻片上封片，顯微鏡觀察；
若是熒光標記的二抗，在潔凈載玻片上滴加抗熒光淬滅封片劑，用尖頭鑷子輕輕將爬片挑起，倒扣在載玻片上封片，熒光顯微鏡觀察；
組織切片樣品：
1. 動物準備：需提前準備實驗動物，并進行體內BrdU標記，。體內標記后根據實驗需要進行取材、固定及制備石蠟切片；
2. 組織石蠟切片脫蠟復水；
3. 修復：組畫筆畫圈圈住組織，將切片浸沒在抗原修復液中，微波加熱修復。自然冷卻；
4. 細胞核染色（可選）：
若后續白光檢測，則用蘇木素染細胞核：切片入蘇木素染液室溫染色5 min，PBS洗3次，每次5 min；
若后續熒光檢測，則用DAPI染細胞核：向組織上滴加DAPI染液室溫染色5 min，傾去DAPI染液，切片經PBS洗3次，每次5 min；
5. 再固定：向組織上滴加4%多聚甲醛室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；
6. 酸化：向切片上滴加1 M HCl覆蓋組織，37℃處理10 min，PBS洗3次，每次5 min；
7. 后固定：再次向切片上滴加4%多聚甲醛覆蓋組織室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；
8. 內源性過氧化物酶淬滅（可選）：向切片上滴加3% H2O2室溫孵育25-30min，去除內源性過氧化物酶。隨后切片經PBS洗3次，每次5 min；
9. 封閉：向切片上滴加封閉液（3% BSA）覆蓋組織，室溫孵育30 min。去除封閉液，不要清洗；
10. Anti-BrdU抗體孵育：向切片上滴加anti-BrdU一抗工作液覆蓋組織，4℃孵育過夜。去除anti-BrdU一抗工作液，PBS洗3次，每次5 min；
11. 二抗孵育：向切片上滴加二抗工作液覆蓋組織，室溫孵育1 h。去除二抗工作液，PBS洗3次，每次5 min。注意，若是用熒光標記的二抗，孵育及洗滌時均需避光；
12. 封片及鏡檢：
若是HRP標記的二抗，則用DAB顯色試劑對組織切片進行顯色，脫水，透明，封片后顯微鏡觀察；
若是熒光標記的二抗，則滴加抗熒光淬滅封片劑封片后熒光顯微鏡觀察。
結果觀察
如果用HRP標記的二抗檢測，細胞核呈深藍色，增殖細胞呈棕色。如果是熒光標記的二抗，細胞核呈藍色熒光（Ex=358 nm，Em=461 nm），增殖細胞為對應二抗的熒光。
注意事項
1. 對于細胞爬片樣品，BrdU的使用濃度和處理時間與細胞種類有關。一般來說，處理腫瘤細胞所需濃度和時間都較低，成纖維細胞或上皮細胞等增殖較慢的細胞需要提高濃度并延長作用時間，建議濃度范圍為20-100 μM，作用時間為40 min-4 h，可根據具體細胞的種類進行摸索調整。
下表為測試的常用細胞處理濃度及時間，僅供參考。
|
細胞 |
BrdU濃度（μM） |
孵育時間（min） |
|
A549 |
40 |
40 |
|
Hela |
40 |
40 |
|
NRK-52e |
40 |
40 |
|
SKOV3 |
80 |
120 |
|
H9C2 |
40 |
40 |
2. 為保證最佳實驗效果，推薦使用本公司生產的其他配套試劑：蘇木素染液(G1004)；DAPI染液(G1012)；DAB顯色試劑盒(G1212），抗熒光淬滅封片劑(G1401)；
3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
產品僅供科研用途，不用于臨床診斷！
凡合肥萬物生物科技有限公司銷售的產品均有嚴格的質量保證。如發現產品存在包裝規格疑問，請于收貨之日起七日內向我公司總部或當地辦事處提出，并請保證該產品，以備本公司進行核對檢驗。如果發現有質量問題，請于收貨后一月內保留產品50%以上的量，以便本公司回收產品進行質檢，確認產品質量。如逾期，則視為已經對本公司產品進行驗收。 聲明：如發生產品索賠事宜，本公司僅在產品價格范圍內酌情賠償，恕不接受超出產品價格范圍之賠償。客戶在使用過程中有任何技術問題可以撥打技術售后服務電話我們隨時給予解答。
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