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產品詳情
操作說明
注意事項
產品描述
JC-1是一種陽離子羰花青染料，能夠穿過細胞膜，在線粒體膜電位的作用下向線粒體聚集定位，是廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針。當線粒體膜電位較高時，JC-1在線粒體膜電位作用下聚集在線粒體的基質中，其主要以聚合物(J-aggregates)的形式存在，呈現出紅色熒光(Ex=585 nm，Em=590 nm)；當細胞狀態不好，線粒體膜電位下降或者喪失，會導致JC-1大多以單體(Monomer)的形式存在于胞漿中，呈現出綠色熒光(Ex=514 nm，Em=529 nm)。因此，可以根據熒光顏色的紅綠轉化以及比例變化來判斷線粒體膜電位變化情況，而線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個重要標志。
JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit)是一種以JC-1熒光探針為主的試劑盒，本試劑盒對JC-1易析出等缺點進行了改良，并在試劑盒并配制了相關試劑，可用于快速靈敏地檢測細胞或純化的線粒體膜電位變化，用于判斷早期的細胞凋亡，也是用來檢測細胞早期凋亡的常用方法。本試劑盒共可以檢測100個6孔板樣品；此外，本試劑盒中還提供CCCP(Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone)試劑，是一種線粒體中氧化磷酸化的質子載體(氫離子載體)和解耦體，能夠促使線粒體對氫離子的通透性發生變化，導致線粒體膜電位下降或者喪失，可作為誘導線粒體膜電位下降的陽性對照。
儲存與運輸
冰袋(wet ice)運輸；
-20℃保存；JC-1(500×)需避光保存，避免反復凍融；JC-1染色緩沖液(10×)和JC-1稀釋液可4℃保存；有效期12個月。
操作步驟
1. JC-1染色工作液以及JC-1染色緩沖液配制：
a. 取2 μLJC-1溶液(500×)與900 μL JC-1稀釋液充分混勻，然后再加入100 μL JC-1染色緩沖液(10×)，旋渦震蕩混勻，配制成JC-1染色工作液備用(注意按順序配制此溶液)；
b. 取適量JC-1染色緩沖液(10×)用去離子水稀釋配制成1×JC-1染色緩沖液備用(后續步驟如無特殊說明，洗滌等步驟均使用1×JC-1染色緩沖液)。
2. 陽性對照組設置：
a. 取適量CCCP(100 mM)用細胞培養液稀釋1000倍得到100 μM CCCP工作液;
b. 用CCCP工作液孵育細胞30 min左右，隨后按照下方的JC-1染色步驟操作檢測線粒體膜電位。
(注意：對于大部分細胞來說，上述處理方式處理過后，相比正常組，CCCP處理誘導后可以看到JC-1大多以單體的形式存在于胞漿中，呈現出較亮的綠色熒光，紅色熒光變弱；但是有些細胞，CCCP的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關文獻資料決定或優化體系摸索最優條件。)
3. 懸浮細胞染色操作：
a. 取1-6×105細胞，1000 g離心3-5 min去除原有培養基，加入JC-1染色緩沖液洗滌1次后，再離心去除JC-1染色緩沖液，用500 μL細胞培養基重懸(可含血清和酚紅)；
b. 然后加入500 μLJC-1染色工作液，避光于CO2培養箱中孵育15-30 min(一般情況20 min即可，也可視情況調整孵化時間)；
c. 孵育結束后，依舊按常規懸浮細胞的處理方法，離心去除JC-1染色工作液后，用JC-1染色緩沖液洗滌2次；
d. 適量JC-1染色緩沖液(1×)或細胞培養液(建議不含酚紅)重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可使用流式細胞儀等儀器分析。
4. 貼壁細胞染色操作(6孔板為例)：
對于貼壁細胞，如需用流式細胞儀檢測，可先收集細胞，重懸后參考懸浮細胞的檢測方法。
a. 去除原有含藥物或其他處理的細胞培養基后，加1 mL JC-1染色緩沖液，洗滌1-2次；
b. 加入1 mL細胞培養基(可含血清和酚紅)；
c. 加入1 mL JC-1染色工作液，輕晃混勻，避光于CO2培養箱中孵育15-30 min；
d. 孵育結束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液，洗滌2次；
e. 加入2 mL JC-1染色緩沖液(1×)或細胞培養液(建議不含酚紅)；
e. 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察或用流式細胞儀等儀器分析。
5. 對于提取純化的線粒體
a. 900 μL JC-1染色工作液中加入100 μL總蛋白量為10-100 μg純化線粒體；
b. 混勻后使用熒光分光光度計(激發波長為485 nm，發射波長為590 nm)或酶標儀(當激發波長不能設置為485 nm時，可以在475～520 nm范圍內設置激發波長)等儀器進行掃描檢測，也可通過熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，可參考步驟6中的波長設置進行檢測。
6. 熒光檢測與分析
a. 檢測JC-1單體的波長參數為Ex=490 nm, Em=525 nm；JC-1聚合物的波長參數為Ex=525 nm, Em=590 nm；注意此處測定熒光時不必把激發光和發射光設置在最大激發波長和最大發射波長，參數設置可以依情況在這參數左右進行一個調整；
b. 熒光顯微鏡拍照時，建議以正常組為標準，確定紅色和綠色熒光的曝光時間，以正常組紅色熒光效果清晰，綠色熒光效果較暗為佳，并分別以正常組的紅色與綠色熒光的曝光時間去拍攝處理組熒光；
c. 對結果的判斷：細胞狀態正常，主要呈現紅色熒光，表明其線粒體膜電位正常；如果出現綠色熒光大幅度增強，說明線粒體膜電位出現下降，其可能處于細胞凋亡早期階段。
注意事項
1. 為了使JC-1充分溶解，請按照操作順序進行JC-1工作液配制。
2. JC-1孵育過后的樣品，建議30 min內檢測完畢。
3. JC-1溶液、JC-1染色緩沖液(10×)如有沉淀生產，可以適當溫浴溶解。
4. JC-1最終檢測時，建議使用不含酚紅的細胞培養液，避免造成背景色干擾，JC-1染色孵育階段酚紅對結果無影響。
5. 如每次使用的JC-1溶液較少，可能要涉及多次的反復凍融，請視情況分裝，盡量避免JC-1溶液多次反復凍融。
6. 操作時請穿實驗服，佩戴一次性手套。
本產品僅供科研用途，不用于臨床診斷！
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