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Western免疫印跡（Western Blot）
來(lái)源：萬(wàn)物 發(fā)布時(shí)間：2021-08-31
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過(guò)融合部分的抗體檢測(cè)。
一、 原理
與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。 該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。
二、WB技術(shù)操作步驟：
1 樣品準(zhǔn)備
1）分別取大約200mg組織加入液氮碾磨成粉末狀，按每200mg組織加900μl上樣Buffer(無(wú)溴酚藍(lán))和100ul 10mg/ml PMSF，混勻，玻璃勻漿器冰點(diǎn)勻漿；
2）4℃，12000rpm離心10min；
3）取上清夜-70℃凍存24hr；
4）4℃ 12000rpm再次離心10min，取上清分裝，一份用于定蛋白，另一份加入溴酚藍(lán)(0.1%(W/V))后于100℃加熱4min，后于-20℃保存待用。
2 定蛋白及計(jì)算電泳上樣量
根據(jù)總蛋白測(cè)定試劑盒說(shuō)明書操作測(cè)定樣本中的總蛋白含量，電泳上樣量定為40ug
3 電泳
1）安裝好電泳裝置；
2）根據(jù)不同的指標(biāo)配制相應(yīng)濃度的分離膠，灌膠約3/5體積，液封(<10%用0.1%SDS,>10%用異丙醇)；
3）30min后，待凝后傾去封液；
4）配5%的濃縮膠，灌膠至距平板頂部2mm處，插入梳子, 30min后，待凝后拔出梳子，用去離子水清洗加樣孔，用濾紙吸干；
5）上樣：各樣品取50ug上樣，marker取10μl上樣(上樣前需按說(shuō)明書進(jìn)行預(yù)處理)；
6）緩慢加入內(nèi)、外槽緩沖液，接通電源，90v電泳至指示劑進(jìn)入分離膠后，調(diào)電壓至150V繼續(xù)電泳；
7）當(dāng)指示劑距平板底端1cm處時(shí)停止電泳；
4 轉(zhuǎn)膜及檢測(cè)
1）準(zhǔn)備2個(gè)12cm的平面皿，一個(gè)裝去離子水浸泡NC膜20min，另一裝轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡海綿和濾紙20min；
2）取下膠，切除濃縮膠部分后，將分離膠浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中約5min；
3）按順序安裝好轉(zhuǎn)膜裝置（黑色板-海綿-三層濾紙-凝膠-硝酸纖維膜-三層濾紙-海綿-紅色板）；
4）完全排除氣泡， 4℃，100mA轉(zhuǎn)膜2h；
5）傾去轉(zhuǎn)膜緩沖液，拆除轉(zhuǎn)膜裝置，將硝酸纖維膜放入麗春紅中搖床染色15min，用去離子水清洗至能看到條帶，后用鉛筆標(biāo)出marker位置，再用去離子水震蕩以去除浮色。在右上角剪去一角以辨上下左右；
6）將膜轉(zhuǎn)移至另一容器中，用5%脫脂奶粉封閉, 4℃過(guò)夜；
7）將膜轉(zhuǎn)移至盡可能小的容器中并加入稀釋好的一抗；
8）37℃搖床孵育約2h；
9）PBST洗滌4次，每次5min；
10）將膜轉(zhuǎn)移至盡可能小的容器中并加入稀釋好的二抗，37℃搖床孵育約30min；
11）PBST洗滌4次，每次5min；
12）將膜轉(zhuǎn)移至盡可能小的容器中并加入BCIP/NBT底物，室溫孵育30min；
13）取出NC膜，用蒸餾水漂洗后晾干；
14）掃描及分析。
三、 注意事項(xiàng)
1、 一抗、二抗的稀釋度、作用時(shí)間和溫度對(duì)不同的蛋白要經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳條件。
2、 顯色液必須新鮮配置使用，最后加入H2O2。
3、 DAB有致癌的潛在可能，操作時(shí)要小心仔細(xì)。
4、客戶要確保檢測(cè)樣本沒(méi)有問(wèn)題。
5、客戶要確保抗體的有效性。
6、實(shí)驗(yàn)周期比較緊張的客戶需特別說(shuō)明。
7、收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：以每張膜8個(gè)樣本收費(fèi)，不足8個(gè)樣本的按8個(gè)樣本收費(fèi)）
四、萬(wàn)物生物|WB實(shí)驗(yàn)周期：
接受樣本后，1-2個(gè)月。
五、萬(wàn)物生物|WB實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：
1、客戶要確保檢測(cè)樣本沒(méi)有問(wèn)題。
2、客戶要確保抗體的有效性。
3、實(shí)驗(yàn)周期比較緊張的客戶需特別說(shuō)明。
4、收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：以每張膜8個(gè)樣本收費(fèi)，不足8個(gè)樣本的按8個(gè)樣本收費(fèi)）
六、萬(wàn)物生物|WB服務(wù)結(jié)果提供：
1、目的蛋白實(shí)驗(yàn)圖片。
2、灰度分析結(jié)果。（免費(fèi)分析）
3、內(nèi)參結(jié)果。（免費(fèi)跑膠）
4、詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟。
5、免費(fèi)提供蛋白樣本保存液。
結(jié)果展示
【一站式整體科研服務(wù)，成就更高水平的科研成果】
標(biāo)書基金實(shí)驗(yàn)咨詢 表觀遺傳組學(xué)分析
課題實(shí)驗(yàn)結(jié)題指導(dǎo) 細(xì)胞分子功能驗(yàn)證
實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)文章潤(rùn)色 動(dòng)物模型裸鼠成瘤
臨床檢測(cè)科研轉(zhuǎn)化 病理染色分子互作
萬(wàn)物生物主營(yíng)業(yè)務(wù)包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立、分子生物學(xué)、載體構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、基因治療實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞功能驗(yàn)證、基因敲出/入、原代培養(yǎng)、高通量測(cè)序、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、高通量高內(nèi)涵篩選、藥效學(xué)評(píng)價(jià)、藥理毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)、慢病毒包裝與穩(wěn)轉(zhuǎn)株建立等多項(xiàng)科研技術(shù)服務(wù)，并建立了涵蓋實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、項(xiàng)目實(shí)施、結(jié)果整理、數(shù)據(jù)分析及策略咨詢等一站式的科研服務(wù)體系并提供全方位科研方案。