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包埋切片
來源：萬物生物 發布時間：2021-11-02
切片法
切片法，是利用銳利的刃具將組織切成極薄的片層，材料須經過一系列特殊的處理，如固定、脫水、包埋、切片、染色等，過程十分繁復。在制作過程中，還要經過一系列的物理和化學的處理，這些處理方法可根據各種不同材料的性質要求進行合理選擇。切片法雖然工序繁瑣，技術復雜，但是，它最能保持細胞間的正常的相互關系，能較好和較長時間地保留細胞的原貌，所以仍然是光學顯微鏡的主要制片方法。
石蠟制片操作程序如下：
1、材料的采集與分割
采集材料應根據制片的目的和要求而定，材料要有代表性，無病蟲害或其它損傷，如要觀察病理解剖，則要取病斑、病癥部位。采下的材料應立即放在標本箱或濕布包起來帶回實驗室進行分割固定（如有條件也可在試驗地采集后進行分割固定）。
為使固定液能迅速的滲透材料，材料要進行分割。分割時動作要迅速，以防材料萎蔫。分割塊的大小，宜小不宜大，一般不超過1cm3，分割后立即殺死固定。
2、殺死與固定
利用藥劑迅速把細胞殺死，以保持材料本來的狀態和結構。常用的固定液有F.A.A固定液、卡諾固定液等。將固定液放在具塞小瓶中，投入材料，蓋好瓶蓋。用F.A.A固定液固定，時間至少24小時。
F.A.A固定液既是良好的固定劑，也是保存劑，因此材料可長期保存在固定液中備用。卡諾固定液穿透力強，固定較小材料一般1~6小時即可，最多不超過24小時。因卡諾固定液不能做保存劑，所以固定后要用95%、85%酒精浸洗，每級約20min.，然后保存在70%的酒精中備用。
3、脫水
脫水的目的是除去組織中的水分，便于透明、浸蠟、包埋等步驟的進行，因為這些程序中所用的藥品都不能與水混合，所以必須脫水。常用的脫水劑為酒精。脫水過程應緩慢進行，不能操之過急或時間過長，以免組織變硬變脆或發生收縮現象。
脫水采用等級脫水（系列脫水），即從較低濃度酒精開始，逐漸替換到高濃度酒精。一般為：50%→70%→80%→95%（此時可加少許番紅，使組織著色便于包埋時定位）→無水酒精（兩次），每級停留時間2~4小時或更長（無水酒精中時間宜短）。
用 95%酒精配制各濃度酒精的方法：設原有酒精濃度為A，所需配制酒精濃度為B，則取Bml原有酒精，加上A-Bml蒸餾水，即可獲得Aml的B%的究竟。例如：95%酒精配成70%的酒精，則取70ml的95%酒精，加上25ml蒸餾水，則配成了95ml的70%的酒精。
4、透明
透明的目的是將脫水劑從材料中除去，使材料透明，增記折光系數；同時便于下步的浸蠟和包埋等程序（因為究竟不能溶解石蠟）。透明劑是一種既能與脫水劑混合，又能與包埋劑混合的藥劑。常用的透明劑為二甲苯和氯仿，適用原則也是逐級進行，可減少材料收縮。
一般步驟是：2/3純酒精+1/3二甲苯→1/2純酒精+1/2二甲苯→1/3純酒精+2/3二甲苯→二甲苯（兩次），每級停留時間0.5~2小時或更長些。二甲苯穿透能力強，但又宜使材料收縮變脆，使用時不能在其中停留時間過長。若材料放入二甲苯中時有白色混濁現象發生，說明材料脫水不徹底，應把材料退回至純酒精中再行脫水。
5、浸蠟
浸蠟的目的是逐漸除去透明劑,并為包埋劑所代替。常用的包埋劑是石蠟。浸蠟過程是使石蠟慢慢溶于浸有材料的透明劑中，溶解在透明劑中的石蠟漸漸深入到材料的細胞中去，最后使透明劑完全被石蠟取代，以便切片。
一般所用的石蠟分軟蠟（熔點40℃ 以下）和硬蠟（熔點40℃以上）。浸蠟過程一般是從低溫到高溫、從低熔點到高熔點逐漸進行，這一過程不能操之過急，否則浸蠟不徹底影響切片。此外，軟材料可用熔點較低石蠟，較硬的材料可用熔點較高的石蠟；冬季可用熔點較低的石蠟，夏季可用熔點較高的石蠟。
石蠟必須純凈，不含雜質。整個浸蠟過程需在恒溫箱內進行（按需要調整溫度）。材料最后一次二甲苯透明后即可浸蠟，浸蠟過程中逐漸使二甲苯揮發，并不斷加入純石蠟，直至石蠟飽和為止。浸蠟時間大約1~2天。
6、包埋（埋蠟、沉床）
材料浸蠟后再換兩次已熔融的純蠟，然后將材料和石蠟一起倒入提前疊好的包埋紙盒中，用加熱的鑷子迅速將材料按一定的間隔和所需的切面擺放整齊，同時用加熱的鑷子趕走材料周圍的氣泡，待紙盒表面的石蠟凝固后將紙盒平放入冷水中，使石蠟迅速凝固。最后從紙盒中取出蠟塊，以便保存。注意將樣品編號封于蠟塊上，以免樣品混淆。
7、修塊
將已包埋好的蠟塊切成小塊，每一小塊包含一塊材料。然后按照所需的切面，用單面刀片將小蠟塊切成梯形，并可粗視到材料切面。然后用燒紅的蠟鏟把蠟塊底部牢固的粘接在載蠟器上。
8、切片
用切片機（如旋轉切片機）將蠟塊切成連續的蠟帶。切片時先把切片刀夾在刀架上，再把載蠟器夾在固定裝置上（注意安裝切刀的角度，刀口運行方向與材料切面平行），然后調整好所需厚度，一般可在7~14微米，視材料和所需觀察對象而定，一般葉片、芽可厚些，胚囊和花粉?？杀⌒D動切片機切片。
9、粘片
切下來的切片經過鏡檢（根據情況也可不檢），將符合要求的切片粘在潔凈的載玻片上。粘片時先在載玻片上滴上一小滴粘片劑（可用蛋青和甘油各50ml，加1g 水楊酸混合而成），加幾滴蒸餾水，然后用鑷子小心把切片放在水上，在35-40℃下，用撥針將切片伸直、展平，傾斜載片，使水流去并烘干。
10、脫蠟、染色、脫水透明和封片
粘片后要經過脫蠟、染色、再次脫水透明，然后封片永久保存。下面以植物生物學中觀察組織結構最常用的番紅-固綠染色法說明脫蠟、染色、脫水透明和封片的過程：
二甲苯 →二甲苯（每次均10~15min.）→1/3純酒精+2/3二甲苯（1~2min.）→1/2純酒精+1/2二甲苯（1~2min.）→2/3純酒精+1/3二甲苯（1~2min.）→純酒精兩次（每次1~2min.）→95%、85%、70%、50%梯度酒精復水（每級1~2min.或更長）→用 1%番紅配50%酒精染色1小時→50%、70%、85%、95%梯度酒精脫水（每級1~2min.或更長）→用0.1%固綠配95%酒精復染2~5秒 →95%酒精脫水1~2分鐘→純酒精兩次（每次1~2min.）→2/3純酒精+1/3二甲苯透明（1~2min.）→1/2純酒精+1/2二甲苯透明（1~2min.）→1/3純酒精+2/3二甲苯透明（1~2min.）→二甲苯 →二甲苯（每次均10~15min.）→加拿大樹膠封片→貼標簽鏡檢及保存。
包埋
切片
實驗注意事項：
1、固定劑應有足夠的量，一般為組織塊體積的10~15倍。
2、根據組織的不同和實驗目的的不同，選取不同的固定劑。
3、固定時間依材料大小、固定劑種類而異，可從1小時到幾時小時，有時中間需要更新固定劑。某些固定劑對組織的硬化作用較強，作用時間應嚴加控制，不能過長。
4、取材切面要平整，厚度不易超過2mm，否則脫水效果不能保證。
5、對于有特許要求的組織，取材時要保證對目的組織的完整保留。
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