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產品詳情
操作說明
注意事項
產品簡介
本產品CY3-Tyramide，為熒光染料CY3標記的酪胺，用于酪胺信號放大技術（TSA，Tyramide signal amplification），以下簡稱TSA技術。TSA技術主要原理：在過氧化氫H2O2存在時，辣根過氧化物酶HRP可以催化酪胺為一種非常活躍的短壽命中間體，在短時間內，中間體可以共價結合到周圍蛋白的富電子表面形成酪胺化復合物，大量富集成以酶為中心的類似“島”狀的聚集團，因使用熒光染料CY3標記了酪胺，使得抗原-抗體結合部位形成大量的熒光素沉積，實現信號放大。此外，可以通過多次重復免疫標記，使用不同的熒光酪胺實現多重熒光染色。
儲存與運輸
冰袋（wet ice）運輸。
-20℃保存，12個月有效。
操作步驟
以組織切片為例，以下實驗步驟中的實驗用水均為純水，涉及到的試劑均需用戶自備：
1. 組織切片脫蠟至水；
2. 抗原修復：根據所使用的一抗及樣本類型，采用合適方式對組織切片進行抗原修復。1×PBS清洗3次，每次5 min；
3. 用免疫組化筆對組織畫圈標記；
4. （可選）向組織滴加組織自發熒光淬滅劑，室溫孵育30 min，水洗5 min；
5. 滅活內源性過氧化物酶：向切片上加入3% H2O2覆蓋組織，室溫避光孵育25 min，阻斷內源性過氧化物酶，以減少非特異性背景染色。1×PBS清洗3次，每次5 min；
6. 封閉：切片水分稍微甩干后，滴加3%BSA或血清封閉30 min。如果一抗是山羊來源，用10%驢血清封閉，其他來源則用3%BSA封閉；
7. 孵育一抗：用1×PBS或封閉液將一抗稀釋至適當濃度。輕輕甩掉切片上的封閉液，滴加稀釋好的一抗覆蓋組織，切片平放于加水的濕盒內4℃孵育過夜。1×PBS清洗3次，每次5 min；
8. 孵育HRP標記的二抗：用1×PBS或封閉液將二抗稀釋至適當濃度，向組織上滴加二抗，室溫孵育50 min。1×PBS清洗3次，每次5 min；
9. 配制含0.03‰ H2O2的Tyramide稀釋液：1×TBST 100 mL，加入100 μL 3%H2O2，混勻即可。因H2O2容易分解，本溶液需現配現用。
10. 配制TSA染色工作液：用上一步得到的Tyramide稀釋液，將iF555-Tyramide稀釋500倍，即每1 mL Tyramide稀釋液與2 μL CY3-Tyramide混勻，得到TSA染色工作液。每個樣品滴加100 μL染色工作液，室溫避光孵育10 min。1×PBS清洗3次，每次5 min；
（注：TSA染色工作液建議現配現用，需4℃避光保存，24h內有效）
11. 微波處理：組織切片置于盛滿抗原修復液（根據組織類型及抗體選擇合適的抗原修復液）的修復盒中進行微波加熱處理，去除已經結合的一抗二抗。此步驟中需防止液體過度蒸發導致的干片。
（注：如需進行雙重或多重熒光染色，則按此步驟往下進行。如不需進行雙重或多重熒光染色，則跳過此步驟，接步驟12進行）
12. 重復步驟7-11，孵育第二個一抗、二抗，以及TSA標記，并微波處理去除一抗、二抗。
13. 細胞核復染DAPI：切片稍甩干后在組織上滴加DAPI染色液，避光室溫孵育10 min。1×PBS清洗3次，每次5 min。
14. （可選）組織自發熒光淬滅：向組織上滴加自發熒光淬滅劑，室溫孵育5 min，流水沖洗3 min。
15. 封片及鏡檢：切片稍甩干后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。選擇合適的熒光通道觀察并采集圖像。切片置于避光切片盒內4℃可保存15天。
注意事項
1. 本產品室溫融化后，使用離心機進行短暫離心，干凈吸頭吹吸混勻后取用。
2. 與熒光二抗相比，TSA試劑盒有更高的靈敏度和更強的信號。因此一抗使用濃度需降低，一般在抗體說明書建議的稀釋比基礎上再擴大5-10倍，以減少非特異性結合導致的背景熒光。建議設置一抗梯度濃度獲得最佳效果。
3. 如背景熒光較強，建議增加組織自發熒光淬滅步驟。
4. 熒光Tyramide的建議稀釋比是1:500，可根據實驗結果調整稀釋比例（建議稀釋比例范圍1:200 - 1:1000）。
5. 如進行多重熒光標記，建議先孵育多抗，后孵育單抗；先孵育低豐度目的蛋白對應的抗體，再孵育高豐度目的蛋白對應的抗體。
6. 操作時請穿實驗服，并佩戴一次性手套。
本產品僅供科研用途，不用于臨床診斷！
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