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雙熒光素酶報告基因檢測
來源：萬物生物 發(fā)布時間：2021-11-02
雙熒光素酶報告基因檢測
一、檢測原理
全基因合成miR潛在結(jié)合位點上下游~500bp（LncRNA、circRNA或mRNA的3’UTR）野生形式WT及結(jié)合位點的突變形式Mut，克隆到psiCHECK-2多克隆位點處（1640-1674）（圖1），然后與miR的mimics/NC共同轉(zhuǎn)染293T細胞測定熒光素酶讀值即可。
二、載體構(gòu)建與Mimics合成
1、構(gòu)建WT miR潛在結(jié)合位點到psiCHECK-2載體，命名為WT；
2、構(gòu)建Mut miR潛在結(jié)合位點到psiCHECK-2載體，命名為Mut（突變模式：A/T與G/C互變）；
3、合成待測miR的Mimmics及陰性對照NC。
三、 實驗分組信息
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psiCHECK- Target 序列 |
miR |
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Target-1 |
1 |
WT |
NC |
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2 |
WT |
Mimics |
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3 |
Mut |
NC |
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4 |
Mut |
Mimics |
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Target-2 |
1 |
WT |
NC |
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2 |
WT |
Mimics |
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3 |
Mut |
NC |
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4 |
Mut |
Mimics |
四、具體實驗步驟：
(一) 細胞轉(zhuǎn)染操作步驟
1、事先準(zhǔn)備好用于轉(zhuǎn)染的分到96孔板中的293T 細胞和目的質(zhì)粒，待細胞密度達到50%-70%為宜。
2、將10 ml DMEM與0.16 mg的lncRNA (circRNA/3’UTR)/Mut目的質(zhì)粒以及5 pmol的miR/Negative.Control（N.C）Mimics充分混勻后室溫放置（溶液A）；然后將10 ml DMEM與0.3 ml 的轉(zhuǎn)染試劑（轉(zhuǎn)染試劑為漢恒生物產(chǎn)品LipoFiter，濃度為0.8 mg/ml）充分混勻（溶液B），室溫放置5 min。
3、將溶液A與溶液B充分混勻，室溫放置20 min。
4、轉(zhuǎn)染前為細胞換取新鮮培養(yǎng)基，之后將轉(zhuǎn)染混合物加入混勻。37℃，5% CO2培養(yǎng)。
5、轉(zhuǎn)染6 h后換取新鮮培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞檢測。
(二) 檢測實驗操作步驟
檢測試劑盒：Promega Dual-Luciferase system
1、將5′PLB (Passive Lysis Buffer)用蒸餾水稀釋至1′PLB，以96孔板每孔100 ml的量加入，用移液槍吹打打散細胞，置于室溫搖床上緩慢搖15分鐘后，將細胞裂解液吸至1.5 ml離心管，4度12000 rpm （13200g）離心10 min，取上清移入新的管子；
2、96孔板中加入Luciferase Assay Reagent II (LAR II)( Luciferase Assay Reagent, Progema)工作液100 ml；
3、加入20 ml細胞裂解液，移液槍吹打混勻2-3次，測定記錄Firefly luciferase值，此值為內(nèi)參值。
4、加入100 ml Stop & Glo? Reagent(Luciferase Assay Reagent, Progema)，移液槍吹打混勻2-3次，測定記錄Renilla luciferase值，此即為報告基因發(fā)光值。
五、 預(yù)期實驗結(jié)果
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標(biāo)書基金實驗咨詢 表觀遺傳組學(xué)分析
課題實驗結(jié)題指導(dǎo) 細胞分子功能驗證
實驗培訓(xùn)文章潤色 動物模型裸鼠成瘤
臨床檢測科研轉(zhuǎn)化 病理染色分子互作